Circulation：单细胞测序揭示了主动脉瘤中的动态细胞群和基因表达模式 | 单细胞专题
论文标题：Single-Cell Transcriptome Analysis Reveals Dynamic Cell Populations and Differential Gene Expression Patterns in Control and Aneurysmal Human Aortic Tissue
刊登日期：2020年10月
发表杂志：Circulation
影响因子：39.918
研究机构：美国心脏协会
技术手段：单细胞转录组测序
文章架构
实验步骤
1、研究人员对11位受试者的升主动脉组织进行单细胞RNA测序分析；
2、根据数据分析予以归类；
3、通过比较每种细胞类型的比例以及ATAA患者与健康对照个体的组织之间的基因表达谱，明确ATAA相关基因的表达特征；
4、此外，还通过结合Hi-C数据和GWAS公开数据的联合分析结果对单细胞RNA测序数据进行综合分析，研究哪些基因可能对ATAA至关重要。
样本基础信息
该研究的实验材料为11名研究参与者的升主动脉组织，包括8名ATAA患者(4名女性和4名男性)和3名对照受试者(2名女性和1名男性)，均在60岁左右，主动脉直径均在5cm左右，并且所有ATAA患者同时伴有高血压，其中5名患者伴有主动脉瓣返流症状。
主要研究内容
图1
首先，该研究通过单细胞转录组测序数据，从人类升主动脉组织中的共鉴定出11种主要细胞类型，并通过高分辨率聚类进一步将它们分为了40个亚型（图1B-1D）。根据top 2000 DEGs，将这11个细胞类型归入非免疫细胞或者免疫细胞。发现3个对照组中有更多的非免疫细胞，8个主动脉瘤组织中有更多的免疫细胞（图1E）。这表明升主动脉瘤壁上损失了许多非免疫细胞，并增加了许多免疫细胞。
图2
已知非免疫细胞在主动脉壁中起着基础和关键的作用，为深入了解升主动脉壁中的非免疫细胞，作者对样本中的所有非免疫细胞（即2个平滑肌细胞簇、内皮细胞簇、成纤维细胞簇和间充质干细胞簇）进行了无监督再聚类分析，获得了15个非免疫细胞亚型，并根据它们特定的基因表达谱重新命名（图2A-2C）。此外，评估了这几类非免疫细胞的特定基因功能（图2D），以及细胞-细胞和细胞-ECM连接分数（图2E）。以下表格展示了这15个细胞亚型的基因表达特征：
图3
单核/巨噬/树突状细胞群在t-SNE图上呈异质性分布，对所有11个单核/巨噬/树突状细胞群进行了无监督的整合重聚类，获得了10中类型的单核/巨噬/树突状细胞。以下表格展示了这11个细胞亚型的基因表达特征：
图4
T淋巴细胞是升主动脉组织中发现的最大细胞群，对所有T淋巴细胞进行无监督重新聚类，根据每个簇中保守基因的表达情况，共获得了11个T淋巴细胞亚群（图4F-4I）。以下表格展示了这11个细胞亚型的基因表达特征：
图5
为了确定ATAA组织中的关键变化，该研究对ATAA和对照之间的基因按照细胞类型进行了差异分析。在40个簇中，有14个显示出500多个差异基因（图5A左）。GSEA分析表明，ATAA组织中有7个簇的氧化磷酸化增强（图5B）。然而，虽然线粒体是氧化磷酸化的主要器官，但在多种细胞类型中线粒体基因的表达降低（图6A）。对编码氧化磷酸化复合体的所有97个基因的分析表明，在ATAA组织中，线粒体氧化磷酸化基因表达均明显降低，而染色质中的氧化磷酸化基因表达上调（图5C）。因此可以提出假设：ATAA组织中的细胞可能显现出线粒体功能障碍。当线粒体氧化磷酸化基因被抑制后，染色质氧化磷酸化基因的表达可能就会增加，从而补偿和维持细胞中关键的氧化磷酸化功能。应激的SMC簇在ATAA组织中显示糖酵解相关基因表达增加，由于氧化磷酸化会产生大量ATP抑制糖酵解进程，这进一步表明氧化磷酸化ATP的产生可能不足以支持SMC的收缩活动。
作者根据细胞类型计算了所有趋化因子基因的表达变化情况，发现有23个簇中的趋化因子基因在ATAA组织中表达显著增加（图5D）。其中12个簇为非免疫细胞，4个为巨噬细胞。这表明ATAA细胞群ATAA细胞群的改变可能主要是因为非免疫细胞和巨噬细胞中趋化因子表达增加的结果，趋化因子表达的增加吸引了远处的免疫细胞，从而使ATAA细胞群众的免疫细胞增多。
图6
最后，作者试图找出参与ATAA启动和发育的DEGs。GSEA分析表明，DEGs中富含4个染色质区域和1个线粒体区域（图6A）。随后作者从GWAS公开数据中提取出所有与主动脉瘤相关的单核苷酸多肽（SNPs），以及这些SNPs的染色质区域，然后计算了富含DEG的染色质区域到动脉瘤细胞相关SNPs的距离。发现在物理意义上，DEGs比随机基因更接近动脉瘤相关SNPs（图6B)。
有研究通过启动子捕获的Hi-C数据，结合GWAS数据，确定了29个可能的SNPs的靶基因。作者从这些数据中提取出了与主动脉瘤相关的SNPs的假定靶基因，然后将这些基因与DEGs交叉，发现了11个基因，这11个基因在对照和ATAA组织的16种细胞类型中差异表达（图6C）。并且在这11个基因中，Twist1和ERG是两个转录因子编码基因。通过GETx数据库，发现ERG在主动脉中高表达，并且ERG被认为是主动脉瘤相关SNP的靶基因。此外，作者发现ERG在ATAA组织的增殖SMC1、增殖SMC2、炎症1、成纤维细胞1和内皮细胞1中均表达降低（图6D）。
为了进一步确定这5个簇中受到ERG调控的潜在靶基因，作者将其他研究中发现的ERG靶基因与DEGs的簇逐个交叉。当这些基因与EC1中的DEGs相交后，有149个受到ERG调控的潜在靶基因。GO富集分析后发现，在EC1中下调的基因参与了细胞凋亡、对活性氧的反应和内质网信号转导（图6E）。除了EC1外，其他四个簇中都没有ERG相关的CHIP-seq数据。从CHIP-ATLAS数据库中获得EC1相关的ERG初始靶点，然后将DEGs与ERG的预测靶点相交，从成纤维细胞1和增殖性SMC2中发现了24个可能受到ERG调控的基因（图6F和6G）。先前报道的一些凋亡抑制因子（CFLAR、TNFAIP3和GSK3B)在EC1中下调，另一个潜在的促炎基因（TMEM173）在成纤维细胞1（Fibroblast1）中上调。说明ERG可能通过直接正向调节抗细胞凋亡基因和负向调节促炎基因，来维持主动脉的正常功能。
总结
上述研究结果表明，ERG可能对主动脉壁的正常生理起关键作用，并在抑制平滑肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞中主动脉瘤的形成方面发挥关键作用。这些发现扩大了我们对Ataa发病机制的理解，并可能有助于开发新的治疗方法。
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